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蛇毒影响凝血系统毒素的鉴定

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   日期:2015-04-06     浏览:14    评论:0    
核心提示:早在蛇伤治疗中蛇毒对凝血系统的影响即已为人们所注目。蛇毒对凝血系统的影响 的研秃除促进了蛇毒药理学和毒理学发展之外,还促进了血液凝固机制研究的发展。血液 凝固“瀑布学说”的建立也是与蛇毒对血液凝固系统影响的研究密切相关的。

早在蛇伤治疗中蛇毒对凝血系统的影响即已为人们所注目。蛇毒对凝血系统的影响 的研秃除促进了蛇毒药理学和毒理学发展之外,还促进了血液凝固机制研究的发展。血液 凝固“瀑布学说”的建立也是与蛇毒对血液凝固系统影响的研究密切相关的。

蛇毒对凝血系统的影响除促凝作用和抗凝作用外,还有纤溶作用。凝血和纤溶这一对 相反的生理过程在体内组成一个精密的生物调控系统,用以维持正常的血液循环。而蛇毒 中的不同毒素或组分对凝血和纤溶的各步反应,几乎都有不同的影响。

一、蛇毒促凝组分的鉴定

(一) 类凝血酶测定的生物学方法

精氨酸酯水解酶类中有不少是具有类凝血酶活性的,前面叙述的方法都是酯酶检测 方法,它们对于类凝血酶的检测并不十分专一,因而要确定具有精氨酸酯酶活性的酶是否 也具有类凝血酶活性,必须用一些生物学方法确证。

本方法是用反应板或试管法测定凝血活力。用反应板时,配制0. 5%的人纤维蛋白原 0.05mol/L pH7.4 Tris-HCl缓冲液中,取0.2ml于反应板凹孔中,加0. lml待测酶 液,记录纤维蛋白原形成纤维蛋白细丝的时间,以刚能被细玻棒挑起细丝所需时间为准。 用试管法时,取0. 5ml上述纤维蛋白原溶液于小试管中,加0. lml待测酶液,记录纤维蛋 白原溶液变浑凝固时间,凝固以溶液在侧转试管时不再流动为准。酶活力单位通过与已知 活力单位的凝血酶比较进行确定(Sato1965)

(二) 复制静脉血栓形成的大鼠模型(李磷仙等,1982)

蛇毒中有多种能在动物体内除去血栓作用的组分,为了模拟体内的作用,有必要复制 动脉、静脉血栓。

肌注4%戊巴比妥钠(40mg/kg)使大鼠麻醉,将大鼠仰卧固定于动物手术台上,于腹 正中线切开皮肤约3cm,从腹白线切开腹膜,按Reyers等的方法略加改进,分离下腔静 脉,于左肾静脉下方用粗细线结扎下腔静脉,缝合腹壁。结扎后2h重新开腹,在结扎下方 2cm处用止血钳夹住血管,将该段管腔内的血液吸进,然后纵行剪开管腔,观察有无血栓 形成。若已形成血栓,则取出血栓,放入真空干燥器内干燥,24h后称栓子重量,并计算血 栓形成百分率,作为判断药物疗效的指标。

(三) 复制动脉血栓形成的大鼠模型(李磷仙等,1982)

大鼠麻醉,固定方法同上,然后按Hladovee法以及Vigdakl法加以改进,剥离一侧颈 总动脉15mm长,用一小块塑料布遮盖伤口附近的组织以免组织温度影响血管壁的表面 温度。以不锈钢电极将该段动脉轻轻提起,用1. 5mA直流电刺激7. 5min。每根不锈钢电 极的直径为1. 3mm,两电极间距1. 5mm。刺激前用半导体点温计测颈总动脉远端的表面 温度值,然后进行刺激,在刺激后的60min内,每隔2min测定颈总动脉远端的表面温度次,并绘制温度曲线。如果动脉内由于血栓形成堵塞血流,以致动脉血不能通过堵塞处流 向头端,则远端的温度突降。从刺激开始至温度突降的时间即为堵塞时间(OT),其长短可 作为判断药物疗效的指标,并做该段动脉的形态学检查以与正常相比。

上述复制动脉、静脉血栓模型的给药方法为:按分组剂量,于结扎下腔静脉或电刺 激颈总动脉前lh,从股静脉内缓缓注入,l0min内注完。对照组注入等容积的生理盐水。

(四) 纤维蛋白凝块结构的电镜观察(管利丰等,1985)

Kay(1967)等人方法略加修改。取0. lml人纤维蛋白原(5mg/ml)0. lml人凝血酶液(40NIH单位/ml)TLE(150fxg/ml)混和,取一滴混合液于涂碳膜之铜网上,于室 温或37X3下放置一定时间后,用几滴生理盐水洗涤铜网,再以31%醋酸铀染色,蒸馏 水洗涤,并以滤纸吸去其多余水分,待铜网于空气中干燥后,在电子显微镜下观察凝块结构。

(五)FPA(血纤肽A)FPB(血纤肽B)样品的制备(管利丰,1985)

蛇毒中的类凝血酶可以水解纤维蛋白原,产生FPAFPB。这两种肽的测定方法如 下:纤维蛋白原冻干粉溶于PH7. 4 0. 05mol/L Tris-HCl缓冲液,最终浓度5mg/ml, 入人凝血酶或蛇毒TLE后反应一定时间,然后于沸水浴中加热2min,使纤维蛋白沉淀, 离心分离沉淀蛋白后,再经高速离心(10 OOOr/min)后,取上清液作高效液相色谱分析。

 

作者:何国昌@久久久久久久新视频研究中心

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